ریزازدیادی Eucalyptus maculata از پایه بالغ به روش کشت درون‌شیشه‌ای

نوع مقاله: علمی- پژوهشی

نویسندگان

1 استادیار

2 کارشناس ارشد فیزیولوژی گیاهی

3 مربی پژوهش

4 استاد

چکیده

توانایی رشد سریع اکالیپتوس‌ها سبب شده تا این جنس در جنگل‌کاری، مصارف صنعتی و دارویی اهمیت فوق‌العاده‌ای پیدا کند. گونه درختی  E. maculata Hookاز نظر تولید برخی ترکیبات شیمیایی و مصارف دارویی نسبت به سایر اکالیپتوس‌ها از اهمیت خاصی برخوردار است. از طرفی به دلیل مشکلات تکثیر جنسی و غیرجنسی این گونه، در این تحقیق امکان تکثیر این گیاه به روش کشت ‌درون‌شیشه‌ای با استفاده از ریزنمونه‌های پایه بالغ مورد بررسی قرار گرفت. ریزنمونه‌های حاصل از پایه بالغ پس از استقرار بر روی محیط کشت پایه MS (Murashige and Skooge) با غلظت یک دوم نیترات و تیمارهای هورمونی مختلف (kinetin) Kin، (Benzylamino purine) BAP، (2-Isopentyladenine) 2ip، (Indole-3-acetic acid) IBA، (Naphtalen Acetic Acid) NAA و (Tidiazorun) TDZ با غلظت‌های متفاوت در شرایط استریل درون‌شیشه‌ای مورد بررسی قرار گرفتند. بعد از یک ماه شاخص‌های رشد ازجمله تعداد شاخه، طول شاخه، تعداد جوانه و سبزینگی ثبت گردید و بهترین تیمار هورمونی شاخه‌زایی، تیمار  mgl-15/02iP ،  mgl-13/0BAP ، mgl-101/0 IBA که در تعداد شاخه (با میانگین 63/4)، طول شاخه (با میانگین 73/2 سانتی‌متر) و میزان سبزینگی (با میانگین75/3) مشاهده شد. مرحله ریشه‌زایی بعد از دو ماه و شاخص‌های مورد نظر ازجمله تعداد ریشه و طول ریشه ثبت گردید و تیمار تلفیقی mgl-15/0IBA  و  mgl-15/0 NAA از نظر طول ریشه (با میانگین 2/0 سانتی متر) بهترین بود. در نهایت نهال‌های حاصل به گلخانه منتقل شده و مراحل سازگاری را طی نمودند.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Micropropagation of Eucalyptus maculata from Mature Stock by tissue culture

نویسندگان [English]

  • Abbas Ghamari Zare 1
  • Mansoureh Sedaghati 2
  • Mitra Emam 3
  • Mohammad Hasan Assareh 4
  • Khadijeh Kiarostami 1
1 Assistant Professor, Research Institute of Forests and Rangelands, Tehran, I.R. Iran
2 MSc, Al-Zahra University, Tehran, I.R. Iran
3 Senior Expert. Research Institute of Forests and Rangelands, Tehran, I.R. Iran
4 Professor, Research Institute of Forests and Rangelands, Tehran, I.R. Iran
چکیده [English]

Due to Eucalyptuspotential as a fast growing species, its utilization for afforestation and industrial and medical purposes is very important. E. maculata Hook. is an important species among the other eucalypts in respect to some chemical components production and medical utilization. Sexual and asexual propagation of this species is difficult, for this reason the trial was conducted to investigate its propagation by tissue culture, using micro mature stocks. The produced explants from the mature stocks, were placed on MS medium (Murashige and Skooge) treated by ½ nitrate and various growth regulators such as Kin (Kinetin), BAP (Benzylamino purine), IBA (Indole-3-acetic acid), 2ip (2-Isopentyladenine), TDZ (Tidiazorun) and NAA (Naphtalen Acetic Acid) at different levels of concentration. After two months, growth indexes, including shoot number, shoot height, root number, root length, bud number and greenness rate were measured and recorded. Results showed that the best shooting treatment was IBA (0.01 mgl-1), BAP (0.3 mgl-1) and 2ip (0.5 mgl-1), in which average shoot number, shoot height and greenness rate were 4.63, 2.73 cm and 3.75, respectively, whereas the best rooting treatment was NAA (0.5 mgl-1) plus IBA (0.5 mgl-1), in which root length was 0.2 cm. Finally, the micropropagated plantlets were transferred to greenhouse to pass their adaptation process.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Eucalyptus
  • Asexual propagation
  • Shooting
  • rooting
  • Tissue culture
  • media culture

فصلنامة علمی - پژوهشی تحقیقات جنگل و صنوبر ایران

جلد 21  شمارة 3، صفحة 593-581، (1392)

 

ریزازدیادی Eucalyptus maculata از پایه بالغ به روش کشت درون‌شیشه‌ای

 

عباس قمری زارع1، منصوره صداقتی2*، میترا امام3، محمدحسن‌عصاره4 و خدیجه کیارستمی5

1- استادیار پژوهش، مؤسسه تحقیقات جنگل‌ها و مراتع کشور،‌ تهران

2*- نویسنده مسئول، کارشناس ارشد،‌ گروه فیزیولوژی گیاهی،‌ دانشکده علوم، دانشگاه الزهرا (س)، تهران. پست‌الکترونیک:sedaghati2012@gmail.com

3- مربی پژوهش، مؤسسه تحقیقات جنگل‌ها و مراتع کشور، تهران

4- استاد پژوهش، مؤسسه تحقیقات جنگل‌ها و مراتع کشور،‌ تهران

5- استادیار، دانشکده علوم، دانشگاه الزهرا (س)، تهران

تاریخ دریافت: 18/7/91                                                                تاریخ پذیرش: 18/2/92

 

چکیده

توانایی رشد سریع اکالیپتوس‌ها سبب شده تا این جنس در جنگل‌کاری، مصارف صنعتی و دارویی اهمیت فوق‌العاده‌ای پیدا کند. گونه درختی  E. maculata Hookاز نظر تولید برخی ترکیبات شیمیایی و مصارف دارویی نسبت به سایر اکالیپتوس‌ها از اهمیت خاصی برخوردار است. از طرفی به دلیل مشکلات تکثیر جنسی و غیرجنسی این گونه، در این تحقیق امکان تکثیر این گیاه به روش کشت ‌درون‌شیشه‌ای با استفاده از ریزنمونه‌های پایه بالغ مورد بررسی قرار گرفت. ریزنمونه‌های حاصل از پایه بالغ پس از استقرار بر روی محیط کشت پایه MS (Murashige and Skooge) با غلظت یک دوم نیترات و تیمارهای هورمونی مختلف (kinetin) Kin، (Benzylamino purine) BAP، (2-Isopentyladenine) 2ip، (Indole-3-acetic acid) IBA، (Naphtalen Acetic Acid) NAA و (Tidiazorun) TDZ با غلظت‌های متفاوت در شرایط استریل درون‌شیشه‌ای مورد بررسی قرار گرفتند. بعد از یک ماه شاخص‌های رشد ازجمله تعداد شاخه، طول شاخه، تعداد جوانه و سبزینگی ثبت گردید و بهترین تیمار هورمونی شاخه‌زایی، تیمار  mgl-15/02iP ،  mgl-13/0BAP ، mgl-101/0 IBA که در تعداد شاخه (با میانگین 63/4)، طول شاخه (با میانگین 73/2 سانتی‌متر) و میزان سبزینگی (با میانگین75/3) مشاهده شد. مرحله ریشه‌زایی بعد از دو ماه و شاخص‌های مورد نظر ازجمله تعداد ریشه و طول ریشه ثبت گردید و تیمار تلفیقی mgl-15/0IBA  و  mgl-15/0 NAA از نظر طول ریشه (با میانگین 2/0 سانتی متر) بهترین بود. در نهایت نهال‌های حاصل به گلخانه منتقل شده و مراحل سازگاری را طی نمودند.

 

واژه‌های کلیدی: محیط کشت، اکالیپتوس، شاخه‌زایی، ریشه‌زایی، کشت بافت، تکثیر غیر جنسی.

 


مقدمه

جنس اکالیپتوس (Eucalyptus) متعلق به خانواده‌ی Myrtaceae بوده و مرکز گسترش آن استرالیاست (Turnbull & Boland, 1984). در حال حاضر توسعه‌ کشت بافت گونه‌های مختلف اکالیپتوس، به منظور جنگلداری و بهره‌برداری در صنایع چوب و کاغذ (Assareh, 2000)، سریع بودن رشد، نرمش اکولوژیکی زیاد، قابلیت کشت در اراضی فقیر، ارزش زینتی، بی‌نیازی از هرس مصنوعی، پایا بودن برگ‌ها، خشک کردن باتلاق‌ها به منظور اهمیت بهداشتی، مقاومت در مقابل خاک‌های شور، تنوع گونه‌ها، مقاومت در مقابل آتش‌سوزی و تولید چوب برای سوخت رو به افزایش است (Javanshir & Mosadegh, 1972). همچنین در مصارف دارویی، تولید روغن‌های فرّار، عسل، تولید مواد تجاری مهم مانند تانن (Tannin) و کینو (Kino)، مقاومت در مقابل آفات و امراض و سایر موارد در سرتاسر جهان کاربرد دارد (Javanshir & Mosadegh, 1972 و Assareh et al., 2007). اکالیپتوس در حدود اوایل قرن بیستم وارد ایران شده و به صورت چند پایه در شمال و جنوب کشور کاشته شد (Assareh & Sardabi, 2007). همچنین اسانس اکالیپتوس در درمان برخی بیماری‌ها کاربرد دارد (Bina et al., 1997).

تکثیر اکالیپتوس می‌تواند از طریق بذر، قلمه و پیوند انجام شود، اما هر کدام از این شیوه‌ها مشکلاتی دارند. تولید بذر اکالیپتوس با توجه به شرایط محیطی سال به سال تغییر می‌کند. معمولاً پس از سال‌هایی که باروری آنها زیاد است دوران رکود که ممکن است 7 سال طول بکشد شروع می‌شود (Assareh & Sardabi, 2007). همچنین تکثیر این گیاه از طریق بذر به دلیل تفرق وسیع ژنتیکی با گیاهان مادری مناسب نیست (Assareh, 2002). ازدیاد از طریق قلمه‌زنی به علت پایین بودن میزان ریشه‌زایی مشکل است، ناسازگاری و رد پیوند نیز مشکل اصلی تکثیر اکالیپتوس‌ها ب‌شمار می‌رود (Lakshmi-Sita, 1993).

کشت بافت روش جایگزین ارزشمندی برای تکثیر رویشی گونه‌های اکالیپتوس با قلمه ساقه است. تنها مزیت کشت بافت، تکثیر سریع درختان نیست، بلکه جوان‌سازی درختان بالغ مهمترین مزیت کشت بافت است (Jenq-Chuan, 1995). ریزازدیادی در مقایسه با روش‌های معمول تکثیر مانند قلمه‌زنی مزایای زیادی دارد و کاربرد آن در باغبانی، کشاورزی و جنگلداری به طور متداول در جهان، در حال گسترش است (Assareh & Sardabi, 2007). در این زمینه پژوهشگران بر روی ریزازدیادی گونه‌های مختلف اکالیپتوس بررسی‌های بسیاری انجام داده‌اند. Nugent et al.(2001)از لپه و هیپوکوتیل دانه‌رست‌های E. globulus Labill کالوس و اندام‌زایی نمودند. Rahim et al.(2003) از قطعات گره​ای           E. camaldulensis Dehn برای بدست آوردن کالوس و اندام‌زایی استفاده کردند. همچنین باززایی گیاه از درختان بالغ برای گونه‌های E. nitens و E. grandis (Furze & Cresswell, 1985)، E. citriodora (Manders et al., 1994)، E. tereticornis (Jambhale & Patil, 1996)،  E. tereticornis × grandis (Joshi et al., 2003) گزارش شده است. از آنجا که گونه مورد بررسی در این پژوهش (E. maculata) تنها یک پایه در ایران دارد و فاقد بذر نیز می‌باشد، به بررسی ریزازدیادی جوانه‌های پایه بالغ آن پرداخته شده است.

 

مواد و روش‌ها

ریزنمونه‌های مورد نیاز از تنها پایه بالغ E. maculata (36-39 ساله) از باغ گیاه‌شناسی صفی‌آباد در دزفول تهیه گردید. شاخه‌ها در اندازه‌های 10 تا 20 سانتی‌متری از درخت مزبور در فصول مختلف جدا شده و وارد مرحله پیش‌سترون‌سازی شامل شستشو با آب جاری، برس‌کشی آب و مایع ظرفشویی و برس‌کشی با اتانول70% شدند. سپس نمونه‌ها به قطعات کوچکتر تقسیم شده و در ظروف تمیزی برای مرحله سترون‌سازی به زیر هود منتقل شدند. برای سترون‌سازی با توجه به اندازه نمونه‌ها و درجه مقاومت آنها نسبت به نفوذ مایع سترون‌کننده و شدت آلودگی نمونه‌ها که خود تابعی از فصل و محل برداشت آنها است، از تیمارهای مختلف استفاده می‌شود‌. در این تحقیق از کلرید جیوه 1/0% در زمان‌های مختلف استفاده شد. در زمان‌های مختلف نمونه‌ها 3 بار با آب مقطر 2 بار تقطیر شستشو داده شدند (جدول1- شکل1). فصول نیز از نظر آماری مقایسه شدند، داده‌های ثبت شده (برحسب درصد) برای آنالیز آماری ابتدا به arcsin تبدیل شده و بعد به روش ANOVA آنالیز گردیده و میانگین‌ها به روش آزمون چنددامنه‌ای دانکن در سطح 1% مقایسه شدند.

برای کشت از ریزنمونه‌هایی به طول 5/0 تا 1 سانتی‌متر دارای جوانه جانبی استفاده شد. در این مرحله ریزنمونه‌‌ها در زیر هود با شرایط استریل به محیط کشت‌‌هایی با تیمارهای مختلف هورمونی منتقل شده (جدول2)، سپس در اتاق رشد (16 ساعت نور با شدت 5000-3000 لوکس روشنایی، 8 ساعت تاریکی و دمای 25 سانتی‌گراد روز- 19 سانتی‌گراد شب) به مدت یک ماه نگهداری شدند. در هر تیمار 4 تکرار و هر تکرار 4 نمونه در قالب طرح کاملاً تصادفی قرار داده شد. سپس شاخص‌های رشد ازجمله: تعداد شاخه، تعداد جوانه، رشد طولی شاخه و میزان سبزینگی برگ‌ها ثبت گردید. میزان سبزینگی بین 4-0 کدگذاری شده که صفر نشانگر خشکی و نکروزگی کامل برگ‌ها و 4 نمایانگر رنگ سبز و شادابی برگ‌ها بود. نتایج به‌دست آمده با استفاده از نرم‌افزار SAS به روش ANOVA آنالیز و میانگین‌ها به روش آزمون چنددامنه‌ای دانکن در سطح 5% مقایسه شدند.

شاخه‌های تولید شده در مرحله پرآوری به طول 5/1 تا 2 سانتی‌متر به‌منظور ارزیابی ریشه‌زایی به محیط القاء ریشه انتقال یافتند. تیمارهای به کار رفته در جدول3 ارائه شده است. ریشه‌زایی گیاهچه‌ها در سه تیمار با 9 تکرار که هر تکرار دارای 4 نمونه بود، در قالب طرح کاملاً تصادفی انجام شد. سپس به اتاق رشد با شرایط ذکر شده منتقل گردید. بعد از دو ماه پارامترهای ریشه‌زایی ازجمله تعداد و طول ریشه اصلی، تعداد ریشه‌های فرعی و وجود تارکشنده (وجود تارکشنده=1 و فقدان تارکشنده= 0) ثبت و نتایج حاصل با استفاده از نرم‌افزار SAS به روش ANOVA آنالیز و میانگین‌ها به روش آزمون چند دامنه‌ای دانکن در سطح 5% مقایسه گردیدند.

 

 

جدول1- فصول و مدت زمان‌های سترون‌سازی نمونه‌های پایه بالغ در محلول کلرید جیوه

فصل

زمان (دقیقه)

بهار

1-3-5

تابستان

3-5-7

پاییز

4-6-8-10

زمستان

4-8-10

 

 

 

 

شکل1- ریزنمونه‌های سترون‌شده پایه بالغ مورد استفاده در ریزازدیادی

 


جدول2- تیمارهای مختلف شاخه‌زایی گیاهچه‌های حاصل از جوانه‌های جانبی پایه بالغ

        هورمون‌ها

تیمارها

اکسین‌ (mgl-1)

سیتوکینین(mgl-1)

IBA

BAP

TDZ

Kin

2ip

01/0

1/0

3/0

5/0

01/0

2/0

5/0

T11

+

-

+

-

-

-

+

T12

+

+

-

-

-

+

-

T13

+

-

-

+

-

-

+

T14

+

-

-

+

-

-

-

+: وجود هورمون، -: فقدان هورمون

 

جدول3- تیمارهای مختلف ریشه‌زایی گیاهچه‌های حاصل از جوانه‌های جانبی پایه بالغ

    هورمون‌ها

تیمارها

اکسین‌ (mgl-1)

IBA

NAA

1/0

5/0

1

1/0

5/0

1

T21

-

-

+

-

-

-

T22

-

-

-

-

-

-

T23

-

+

-

-

+

-

+ : وجود هورمون، - : فقدان هورمون

 


نتایج

فصل مناسب برای سترون‌سازی ریزنمونه‌های پایه بالغ پس از استفاده از تیمارهای زمانی مختلف تعیین گردید و بیشترین درصد زنده‌مانی (سبز ماندن ریزنمونه و جوانه زدن) و آلودگی نیز به‌دست ‌آمد. در بین فصل‌های مختلف سال، نمونه‌های برداشت شده در فصل تابستان با بالاترین درصد زنده‌مانی (85/20%) و بهار با کمترین میزان آلودگی (62/0%)، بهترین فصول برای ریزازدیادی شناسایی گردید که با سایر فصول اختلاف معنی‌داری داشتند (شکل2). سترون‌سازی محلول 1/0% HgCl2 به مدت یک دقیقه با سه بار شستشوی آب مقطر سترون، به لحاظ کم بودن میزان آلودگی بعد از سترون‌سازی و نیز درصد بقاء بیشتر، بهترین تیمار سترون‌سازی در نظر گرفته شد. در هر فصل نیز بهترین تیمار تعیین و در جدول4 ارائه شده است.

 

 


جدول4- میانگین درصد زنده‌مانی و آلودگی تیمارهای زمانی سترون‌سازی ریزنمونه‌های پایه بالغ با محلول (1/0% )HgCl2

فصول سال

مدت زمان (دقیقه)

میزان زنده‌مانی (%)

میزان آلودگی (%)

بهار

1*

4/56

82/1

3

9/25

45/3

5

6/34

85/3

تابستان

3

20

5/2

5*

43/21

0

7

1/21

6/2

پاییز

4

7/11

15

6

7/11

3/18

8*

15

7/11

10

25/6

6/15

زمستان

4*

10

3/23

8

0

30

10

8/3

0

12

2/2

3/13

15

0

9/5

*: تیمار بهتر در هر فصل

 

         

الف                                                      ب

شکل2- مقایسه میانگین اثر فصول بر سترون‌سازی ریزنمونه‌های حاصل از پایه بالغ:  الف) درصد زنده‌مانی ب) درصد آلودگی (بر اساس مقایسه میانگین چند دامنه‌ای دانکن).

 

 

به‌منظور ریزازدیادی ریزنمونه‌های (جوانه‌های جانبی) پایه بالغ، تیمار mgl-1 5/0BAP، mgl-101/0 IBA (T14) با کمترین طول شاخه (با میانگین 7/1 سانتی‌متر) با سایر تیمارها تفاوت آماری داشت. تیمار mgl-13/0 BAP، mgl-15/0 2ip، mgl-101/0 IBA (T11) در تعداد شاخه (با میانگین 69/4) با T12، طول شاخه (با میانگین 78/2 سانتی‌متر) با T14، تعداد جوانه (با میانگین 7/34) با T12 اختلاف آماری داشت. البته از نظر میزان سبزینگی بین تیمارها اختلاف آماری مشاهده نشد. در کل به نظر تیمار T11 در شاخص‌های رشد بهتر عمل نمود ولی در تعداد جوانه تیمار mgl-15/0 BAP، mgl-12/0 kin، mgl-101/0 IBA (T13) بهتر بود و با تیمار mgl-11/0 BAP، mgl-12/0 kin، mgl-101/0 IBA (T12) تفاوت آماری داشت. وجود 2ip در کنار BAP پاسخ مناسبی ارائه داد، ولی استفاده از BAP به تنهایی مناسب نبود (جدول5، شکل3 و 5-الف، ب و د).

شاخه‌های حاصل از مرحله پرآوری پایه بالغ به سه تیمار ریشه‌زایی مذکور منتقل شد. نتایج نشان داد که تیمار تلفیقی mgl-15/0 IBA و  mgl-15/0 NAA در تعداد ریشه (با میانگین 622/0) با سایر تیمارها تفاوت آماری داشته ولی در طول ریشه (با میانگین 193/0 سانتی‌متر) با تیمار T22 تفاوت آماری داشته است (جدول6، شکل5-ج). سپس نمونه‌های ریشه‌دار شده به گلخانه منتقل گردیدند و مراحل سازگاری را طی کردند (شکل6).

 

 

جدول5- تجزیه واریانس اثر سیتوکینین‌های مختلف در ریزازدیادی نمونه‌های حاصل از پایه بالغ E. maculata بر شاخص‌های رشد

Pr>F

F Value

میانگین مربعات

درجه آزادی

منابع تعییرات

489/0

88/0

4/1

3

اثر هورمون بر تعداد شاخه

02/0

51/5

84/0

3

اثر هورمون بر طول شاخه

082/0

09/3

380

3

اثر هورمون بر تعداد جوانه

4824/0

89/0

223/0

3

اثر هورمون بر میزان سبزینگی

-

-

1/14

9

خطای آزمایش تعداد شاخه

-

-

152/0

9

خطای آزمایش طول شاخه

-

-

123

9

خطای آزمایش تعداد جوانه

-

-

24/2

9

خطای آزمایش میزان سبزینگی

 

   

       

 

شکل3- مقایسه میانگین اثر سیتوکینین‌های مختلف بر شاخه‌ایی ریزنمونه‌های حاصل از پایه بالغ بر شاخص‌های رشد (بر اساس مقایسه میانگین چند دامنه‌ای دانکن).

{T11: ( mgl-13/0)BAP، (mgl-15/0) 2ip، (mgl-101/0)IBA، T12: ( mgl-11/0)BAP، (mgl-12/0) kin، (mgl-101/0)IBA، T13: (mgl-15/0) BAP، (mgl-15/0) 2ip، (mgl101/0)IBA، T14: ( mgl-15/0) BAP، (mgl-101/0)IBA}.

 


جدول6- تجزیه واریانس اثر اکسین‌های مختلف در ریزازدیادی نمونه‌های حاصل از پایه بالغ E. maculata بر شاخص‌های رشد

Pr>F

F Value

میانگین مربعات

درجه آزادی

منابع تعییرات

0441/0

82/3

93/0

2

هورمون بر تعداد ریشه اصلی

1056/0

6/2

079/0

2

هورمون بر طول ریشه اصلی

-

-

24/0

16

خطای آزمایش تعداد ریشه اصلی

-

-

03/0

16

خطای آزمایش طول ریشه اصلی

        

شکل4- مقایسه میانگین اثر سیتوکینین‌های مختلف بر ریشه‌زایی ریزنمونه‌های حاصل از پایه بالغ بر شاخص‌های رشد (بر اساس مقایسه میانگین چند دامنه‌ای دانکن).

{T21: (mgl-11) IBA، T22: بدون هورمون، T23: (mgl-15/0)IBA،( mgl-15/0) NAA}.

 

        

 

 cm2

                   شکل6- الف) گیاهان قبل از سازگاری،                    ب) گیاهان کشت بافتی به روش مرسوم بعد از سازگاری

 

 


 

بحث

بهترین فصل برای ریزازدیادی، فصل بهار از نظر کمترین آلودگی و فصل تابستان از نظر بیشترین زنده‌مانی بود که با سایر فصول اختلاف معنی‌دار داشت و فصل زمستان بیشترین آلودگی را نشان داد. نتایج حاصل از تیمارهای سترون‌سازی ریزنمونه‌های پایه بالغ (شامل جوانه‌های انتهایی و جانبی درختان بالغ) نشان داد که تیمار سترون‌سازی محلول 1/0% HgCl2 به مدت 1 دقیقه به لحاظ کم بودن میزان آلودگی بعد از سترون‌سازی و نیز درصد بقاء بیشتر بهترین تیمار سترون‌سازی بود. در مرحله پیش‌سترون‌سازی، برس‌کشی سطح جوانه‌ها با مایع ظرفشویی و اتانل، در حذف کرک‌ها و ترشحات صمغی سطح جوانه‌ها مؤثر بوده و امکان وجود آلودگی‌های سطحی را به حداقل خود می‌رساند (Emam & Shahrzad, 2002). محلول کلرور مرکوریک 1/0% از سمی‌ترین محلول‌های سترون‌سازی است که باید در غلظت پایین با زمان کوتاه بر نمونه‌ها اثر بگذارد تا از انهدام بافت‌ها توسط آن جلوگیری شود. مطابق با گزارشهای ارائه شده، مناسب‌ترین زمان سترون‌سازی با محلول کلرور مرکوریک 1/0% در گیاهان مختلف متفاوت بوده، به‌طوری‌که درPopulus caspica در مدت شش دقیقه بهترین تیمار سترون‌سازی در فصل پاییز بوده (Emam & Shahrzad, 2002 ) و درE. gongylocarpa نیز 2 و 8 دقیقه اعلام شده است (Assareh et al., 2007).

بررسی اثر تنظیم‌کننده‌های رشد بر رشد طولی، تعداد شاخه‌ها و ریشه‌زایی E. maculata نشان داد که هر یک از این صفات به یک نوع تنظیم‌کننده رشد پاسخ بهتری می‌دهند. بررسی اثر سیتوکینین‌ها بر تعداد شاخه نشان داد که بهترین تیمار ضریب ازدیاد شاخه در پایه بالغ، تیمار mgl-1 5/0 2iP، mgl-1 3/0 BAP، mgl-1 01/0 IBA بود. همچنین اثر مثبت کاربرد توأم سیتوکینین‌ها در افزایش رشد طولی شاخه توسط محققان دیگر نیز مورد بررسی قرار گرفته است، ازجمله Lakshmi-Sita (1993) که با تلفیق mgl-1 1/0 BAP و mgl-1 5/0 Kin در محیط MS در E. tereticornisافزایش رشد طولی و ازدیاد شاخه را مشاهده کرد. Bunn (2005) نیز در آزمایشی در Eucalyptus spp. بیان داشت که ترکیب BAP و Kin بر تکثیر شاخه نسبت به وجود هر یک از آنها به تنهایی اثر بهتری داشته است. همچنین بهترین تیمار شاخه‌زایی با کیفیت مناسب، ترکیب mgl-1538/0 Kin و  mgl-10563/0 BAP بر روی E. impensa مشاهده شد (Bunn, 2005).

Cortezzi & Mendes (1989) در E. globulus بهترین تکثیر شاخه را در mgl-1 5/0 BAP وmgl-1 01/0 IBA مشاهده نمودند. Koriesh et al. (2002) نیز بهترین شاخه‌زایی روی E. citriodoraرا در محیط کشت MS حاوی mgl-1 5/0 BAP به‌دست آوردند.Assareh et al. (2006)  بهترین تیمار شاخه‌زایی در E. camadulensis و E. microcarpa را  mgl-101/0TDZ  و  mgl-15/0 NAA و تیمار mgl-15/0 2iP، mgl-11/0BAP و mgl-101/0 IBA را در E. melliodora معرفی نمودند. Assareh et al. (2007) نیز تیمار mgl-1 2/0 Kin، mgl-1 1/0 BAP و  mgl-125/0 GA3 را بهترین تیمار شاخه‌زایی در           E. gongylocarpa Blakely اعلام نمودند.

BAP به‌عنوان سیتوکینین بسیار فعال بر تکثیر شاخه نشان داده شده است (Roux & Van Staden, 1991، McComb et al., 1996) با توجه به این مسئله، در این مطالعه نیز از BAP در غلظت‌های مختلف استفاده شد که غلظت mgl-13/0 آن در کنار mgl-15/0 2ip در شاخص‌های رشد پاسخ‌ بهتری داده است (شکل4 تیمار T11).

کینتین در القا تکثیر شاخه با BAP هم مولار خود در بیشتر گونه‌های چوبی (درختی)، اثر کمی دارد (George & Sherrington, 1993). در این مطالعه وجود 2ip به جای kin پاسخ بهتری در شاخه‌زایی نشان داد. ترکیب BAP و Kin نیز برای شاخه‌زایی پایه بالغ‌ این گونه ترکیب مناسبی است. ولی استفاده از mgl-15/0  2iPو  mgl-13/0 BAP از همه بهتر بود.

در ریزازدیادی E. maculata، شاخه‌زایی بسیار آهسته انجام شد.(2005) Bunn نیز اظهار داشت که ساقه‌ها در کشت درون‌شیشه‌ای E. impensa نیز رشد بطئی داشتند و یا رشد آنها متوقف شده بود، این پاسخ‌های مورفولوژیکی در کشت درون شیشه‌ای سایر گونه‌های اکالیپتوس‌ نیز گزارش شده است (Bennet & McComb, 1982، McComb et al.,1996). (1992) Bennet بیان داشت که طول شاخه در E. globulus Labill در محیط دارای کینتین طویلتر بوده و برگ‌ها شاداب‌تر بر روی ساقه باقی ماندند، اما تکثیر شاخه آن به نسبت کم بوده است.

در ریزازدیادی با توجه به اینکه بین تیمارها اختلاف معنی‌داری وجود نداشت ولی از آنجایی‌که هدف، تکثیر شاخه با سبزینگی و شادابی بهتر است، تیمار mgl-1 5/0 2iP، mgl-1 3/0BAP و mgl-1 01/0IBA برای تکثیر گونه E. maculata بهتر به نظر می‌رسد.

برای برظرف کردن پدیده شیشه‌ای شدن در محیط MS از نصف غلظت نیترات در محیط کشت استفاده شد که (1989) Mclaughtin & Karnoskey نیز این پدیده را به همین طریق برطرف نمودند.

بهترین تیمار ریشه‌زایی، تیمار تلفیقی mgl-15/0 IBA و  mgl-15/0 NAA بود. البته در تحقیقات بسیاری استفاده از IBA به تنهایی پاسخ بهتری داده که بهترین تیمار ریشه‌زایی در گونه E. gongylocarpa Blakely (Assareh et al., 2007) ، E. citriodora (Koriesh et al., 2002) و E. dunni(Cortezzi & Mendes, 1989) تیمار mgl-1 1 IBA بوده است.

Bunn (2005) نیز در E. impensa، با استفاده از تیمار تلفیقی IBAوNAA ، بهترین تیمار ریشه‌زایی را mgl-1 016/1 IBA و mgl-1 0931/0 NAA معرفی کرد و در گونه E. phylacis L. Jhnson and K. Hill. تیمار هورمونی mgl-1 016/1 IBA را بهترین تیمار ریشه‌زایی اعلام نمودند که با نتایج به‌دست آمده در این پژوهش مغایرت داشت. احتمالاً نوع گونه، غلظت هورمون‌ها و ... علت مغایرت باشد. البته Ahuja (1982) نیز در صنوبرهای بالغ Aspen در حضور NAA و IBA به‌ترتیب در غلظت‌های 1/0 و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر ریشه‌زایی مناسبی داشت که با نتایج این تحقیق مطابقت داشت.

لازم به ذکر است که در بعضی گونه‌های اکالیپتوس، مانند E. marginata و E. intens، القا ریشه به سختی و در بعضی مانند E. camadulensis Dehnh نسبتاً ساده انجام می‌گیرد (McComb & Bennet, 1986). گونه     E. globulus به آسانی تکثیر می‌یابد، اما در شرایط درون‌شیشه‌، ریشه‌زایی حتی زمانی‌که نمونه‌ها از دانه‌رست گرفته شده باشند، نیز به سختی امکان‌ می‌پذیرد (Hartney, 1983). ریشه‌زایی E. maculata نیز در این پژوهش همین مطلب را تأیید می‌نماید. چندین گزارش درباره بازدارنده‌های ریشه‌زایی ویژه در اکالیپتوس وجود دارد. برای مثال سه بازدارنده G (بازدارنده ریشه‌زایی) از E. grandis بالغ جدا و از نظر شیمیایی شناسایی شده است. یک بازدارنده از عصاره پایه‌های بالغ E. deglupta  به‌‌دست آمد و اخیراً ترکیب Grandinol از برگ‌های بالغ E. grandis بدست آمده است. بررسی‌ها نشان داده که ریشه‌زایی قلمه‌های درختانی با بیش از یک سال سن به آسانی صورت گرفته، اما قلمه‌های درختان پنج ساله ریشه تولید نمی‌کنند، احتمالاً به این دلیل که غلظت بازدارنده‌های ریشه‌زایی در برگ‌های مسن افزایش می‌یابد و افزایش آن منجر به کاهش توان ریشه‌زایی قلمه‌ها می‌گردد. همچنین وجود تراوشات فنلی نیز مانع ریشه‌زایی می‌شود (Assareh & Sardabi, 2007).

از طرفی Gupta et al. (1981) بیان داشتند که درصد ریشه‌زایی با طولانی‌تر شدن زمان کشت درE. rudis،    E. citriodora و E. marginata بیشتر شد و شاخه‌های کشت شده E. citriodora بعد از چهار بازکشت ریشه‌‌دار شدند. برای E. rudis یک دوره چهار ماهه مورد نیاز بود و E. marginata ریشه‌زایی بعد از دوازده ماه انجام شد (Assareh & Sardabi, 2007). در این تحقیق نیز         E. maculata بعد از دو ماه ریشه‌زایی انجام شد. در پایان پیشنهاد می‌شود که بهینه‌سازی محیط کشت نمونه‌های پایه بالغ و همچنین بهره‌گیری از اسانس این نمونه‌های کشت بافتی و مقایسه با پایه بالغ می‌تواند مکمل تحقیق حاضر باشد.

 

سپاسگزاری

این پژوهش در گروه تحقیقات زیست‌فناوری منابع طبیعی مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور انجام شد. بدین‌وسیله از همکاری صمیمانه کلیه همکاران مؤسسه مذکور، به‌ویژه گروه تحقیقات زیست فناوری منابع طبیعی و به‌خصوص سرکار خانم‌ مهندس شکوفه شهرزاد و طیبه‌ سهیلا نراقی و همچنین از حمایت‌های بی‌دریغ دانشگاه الزهرا (س) سپاسگزاری می‌شود.

 

منابع مورد استفاده

References

- Ahuja, M.R., 1982. Somatic cell differentiation and rapid clonal propagation of aspen. Silvae Genetica, 32: 131-135.

- Assareh, M.H., 2000. Somatic embryogenesis in some Eucalyptus sp. Iranian Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research, 236: 11-32

- Assareh, M.H., 2002. Mass production of Eucalyptus camadulensis plantlet under photoautotrophic conditions. Pajohesh-va-Sazandegi (In Natural Resources), 53: 79-83.

- Assareh, M.H., Ghorbanli, M., GhamariZare, A., and Akbari Khabaz, M., 2007. Micropropagation, organogenesis and using new method of semi-photoautotrophic conditions in Eucalyptus gongilocarpa. Pajohesh-va-Sazandegi (In Natural Resources), 75: 134-145.

- Assareh, M.H. and Sardabi, H., 2007. Eucalyptus (Description, Illustration and propagation by advanced techniques). Research Institute of Forests and Rangelands, 672 p.

- Assareh, M.H., Vatanpour, Z., Kiarostami, KH. and GhamariZare, A., 2006. Semiphotoautotrophic micropropagation on three Eucalyptus species. Pajohesh-va-Sazandegi (In Natural Resources), 73: 150-156.

- Bennet, I.J. and McComb, J.A., 1982. Propagation of Jarrah (E. marginata) by organ and tissue culture. Australian forest Research, 12: 121-127.

- Bennet, I.J., McComb, J.A., Tonkin, CM. and McDavid, D.A.J., 1992. Effect of cytokinins on multiplication and rooting of Eucalyptus globulus and other Eucalyptus species. In: Proceedings of conference on mass production technology for genetically improved fast growing forest tree species, France. AFOCEL: 195-201.

- Bina, S., Siddiqui, F., Sabira, B. and Salimuzzaman, S., 1997. Isolation and structural Elucidation of acylated pentacyclic triterpenoides from the leaves of E. camaldulensis var. Obtusa. Journal of Planta Medica, 63(1): 47-50.

- Bunn, E., 2005. Development of In vitro methods for ex site conservation of E. impensa, an endangered mallee from southwest Western Australia. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 83: 97-102.

- Cortezzi, M.E. and Mendes, S., 1989. Micropropagation of Eucalyptus dunni Maid. Annals of Forest Science, 46: 140-144.

- Emam, M. and Shahrzad, SH., 2002. Micropropagation of Populus caspica. Pajohesh-va-Sazandegi (In Natural Resources), 53: 84-89.

- Furze, M.J. and Cresswell, C.F., 1985. Micropropagation of Eucalyptus grandis and E. nitens, using tissue culture techniques. South African Forestry Journal, 135: 20-30.

- George, E.F. and Sherrington, P.D., 1984. Plant propagation by tissue culture (part I: The technology). Exegetics LTD, UK, 709p.

- Gupta, P.K., Maskarenhas, A.F. and Jagannathan, V., 1981. Tissue culture of forest trees clonal propagation of mature trees of Eucalyptus citriodora Hook by tissue culture. Plant Science Lett Letters, 20: 195-201.

- Hartney, V.J., Barker, P.K., 1983. The vegetative propagation of eucalyptus by tissue culture. Silviculturae, 8: 791-792.

- Jambhale, N.D. and Patil, S.C., 1996. Micropropagation of elite Eucalyptus types through shoot tip culture. Indian Forester, 122: 61-64.

- Javanshir, K. and Mosadegh, A., 1972. Eucalyptus, University of Tehran Press. 434p.

- Jenq-Chuan, Y., 1995. Vegetative propagation of adult Eucalyptus grandis x urophylla and comparison of growth between micropropagation plantlets and rooted cuttings. Plant Cell Reports, Is: Horticulturae, 393: 170-173.

Joshi, I., Bisht, P., Sharma, V.K. and Uniyal, D., 2003. In vitro clonal propagation of mature Eucalyptus F1 hybrid (Eucalyptus tereticornisSM x E. grandis Hill ex Maiden. Silvae Genetica, 52: 110-113.

- Koriesh, E.M., Abd El-Fattah, Y.M., El-Dayem, M.A. and El-Etriby, M.A., 2002. Micropropagation of juvenile Eucalyptus citriodora. Acta Horticulture, 625: 283-288.

- Lakshmi-sita, G., 1993. Micropropagation of Eucalyptus. Kluwer Academic Publisher, Netherlands, 263-280.

- Le Roux, J.J. and Van Staden, J., 1991. Micropropagation and Tissue culture of Eucalyptus- a review. Tree physiology, Heron publishing- Victoria, Canada, 9: 435-477.

- Manders, G., Otoni, W.C., Dutra, W.C., Blackhall, F.B., Vaz, N.W., Power, J.B. and Davey, M.R., 1994. Transformation of Passionfruit (Passiflora edulis) using Agrobacterum tumefaciens. Plant Cell Reports, 13: 697-702.

- McComb, J.A., Bennet, I.J. and Tonkin, C., 1996. In vitro propagation of Eucalyptus species. In: Taji A.M. and Williams, R.P. (eds) Tissue culture of Australian plants. University of New England, Armidale: 112-156.

- McComb JA., Bennet I.J., 1986. Eucalyptus spp. In: Bajaj YPS, ed. Biotechnology in agriculture and forestry 1: Trees I. Berlin: Springer Verlag, 340-362.

- McLaughtin, J. and Karnoskey, D.F., 1989. Controlling vitrification in Larix deciduas via culture media manipulation. Canadian Journal of Forest Research, 19: 1334-1337.

- Nugent, G., Chandler, S.F., Whiteman, P. and Stevenson, T.W., 2001. Adventitious bud induction in Eucalyptus globulus Labill. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 37:388-391.

- Rahim, F., Jabeen, M. and Ilahi, I., 2003. Masspropagation in Eucalyptus camaldulensis Dehn. Asian Journal of Plant Science, 2(2):184-187.

- Turnbull, J.W. and Boland, D.J., 1984. Eucalyptus. Biologist, 31: 49-56.

 

Micropropagation of Eucalyptus maculata from Mature Stock by tissue culture

 

A. Ghamari Zare1,M. Sedaghati2*, M. Emam3, M. H. Assareh4 and KH. Kiarostami5

1- Assistant Professor, Research Institute of Forests and Rangelands, Tehran, I.R. Iran.

2*- Corresponding Author, MSc, Al-Zahra University, Tehran, I.R. Iran.Email: sedaghati@rifr-ac.ir

3- Senior Expert. Research Institute of Forests and Rangelands, Tehran, I.R. Iran.

4- Professor, Research Institute of Forests and Rangelands, Tehran, I.R. Iran.

5- Assistant Professor, Al-Zahra University, Tehran, I.R. Iran.

Received: 09.10.2012                                                        Accepted: 07.05.2013

 

Abstract

Due to Eucalyptuspotential as a fast growing species, its utilization for afforestation and industrial and medical purposes is very important. E. maculata Hook. is an important species among the other eucalypts in respect to some chemical components production and medical utilization. Sexual and asexual propagation of this species is difficult, for this reason the trial was conducted to investigate its propagation by tissue culture, using micro mature stocks. The produced explants from the mature stocks, were placed on MS medium (Murashige and Skooge) treated by ½ nitrate and various growth regulators such as Kin (Kinetin), BAP (Benzylamino purine), IBA (Indole-3-acetic acid), 2ip (2-Isopentyladenine), TDZ (Tidiazorun) and NAA (Naphtalen Acetic Acid) at different levels of concentration. After two months, growth indexes, including shoot number, shoot height, root number, root length, bud number and greenness rate were measured and recorded. Results showed that the best shooting treatment was IBA (0.01 mgl-1), BAP (0.3 mgl-1) and 2ip (0.5 mgl-1), in which average shoot number, shoot height and greenness rate were 4.63, 2.73 cm and 3.75, respectively, whereas the best rooting treatment was NAA (0.5 mgl-1) plus IBA (0.5 mgl-1), in which root length was 0.2 cm. Finally, the micropropagated plantlets were transferred to greenhouse to pass their adaptation process.

 

Keywords: Eucalyptus, asexual propagation, shooting, rooting, tissue culture, media culture

- Ahuja, M.R., 1982. Somatic cell differentiation and rapid clonal propagation of aspen. Silvae Genetica, 32: 131-135.

- Assareh, M.H., 2000. Somatic embryogenesis in some Eucalyptus sp. Iranian Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research, 236: 11-32

- Assareh, M.H., 2002. Mass production of Eucalyptus camadulensis plantlet under photoautotrophic conditions. Pajohesh-va-Sazandegi (In Natural Resources), 53: 79-83.

- Assareh, M.H., Ghorbanli, M., GhamariZare, A., and Akbari Khabaz, M., 2007. Micropropagation, organogenesis and using new method of semi-photoautotrophic conditions in Eucalyptus gongilocarpa. Pajohesh-va-Sazandegi (In Natural Resources), 75: 134-145.

- Assareh, M.H. and Sardabi, H., 2007. Eucalyptus (Description, Illustration and propagation by advanced techniques). Research Institute of Forests and Rangelands, 672 p.

- Assareh, M.H., Vatanpour, Z., Kiarostami, KH. and GhamariZare, A., 2006. Semiphotoautotrophic micropropagation on three Eucalyptus species. Pajohesh-va-Sazandegi (In Natural Resources), 73: 150-156.

- Bennet, I.J. and McComb, J.A., 1982. Propagation of Jarrah (E. marginata) by organ and tissue culture. Australian forest Research, 12: 121-127.

- Bennet, I.J., McComb, J.A., Tonkin, CM. and McDavid, D.A.J., 1992. Effect of cytokinins on multiplication and rooting of Eucalyptus globulus and other Eucalyptus species. In: Proceedings of conference on mass production technology for genetically improved fast growing forest tree species, France. AFOCEL: 195-201.

- Bina, S., Siddiqui, F., Sabira, B. and Salimuzzaman, S., 1997. Isolation and structural Elucidation of acylated pentacyclic triterpenoides from the leaves of E. camaldulensis var. Obtusa. Journal of Planta Medica, 63(1): 47-50.

- Bunn, E., 2005. Development of In vitro methods for ex site conservation of E. impensa, an endangered mallee from southwest Western Australia. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 83: 97-102.

- Cortezzi, M.E. and Mendes, S., 1989. Micropropagation of Eucalyptus dunni Maid. Annals of Forest Science, 46: 140-144.

- Emam, M. and Shahrzad, SH., 2002. Micropropagation of Populus caspica. Pajohesh-va-Sazandegi (In Natural Resources), 53: 84-89.

- Furze, M.J. and Cresswell, C.F., 1985. Micropropagation of Eucalyptus grandis and E. nitens, using tissue culture techniques. South African Forestry Journal, 135: 20-30.

- George, E.F. and Sherrington, P.D., 1984. Plant propagation by tissue culture (part I: The technology). Exegetics LTD, UK, 709p.

- Gupta, P.K., Maskarenhas, A.F. and Jagannathan, V., 1981. Tissue culture of forest trees clonal propagation of mature trees of Eucalyptus citriodora Hook by tissue culture. Plant Science Lett Letters, 20: 195-201.

- Hartney, V.J., Barker, P.K., 1983. The vegetative propagation of eucalyptus by tissue culture. Silviculturae, 8: 791-792.

- Jambhale, N.D. and Patil, S.C., 1996. Micropropagation of elite Eucalyptus types through shoot tip culture. Indian Forester, 122: 61-64.

- Javanshir, K. and Mosadegh, A., 1972. Eucalyptus, University of Tehran Press. 434p.

- Jenq-Chuan, Y., 1995. Vegetative propagation of adult Eucalyptus grandis x urophylla and comparison of growth between micropropagation plantlets and rooted cuttings. Plant Cell Reports, Is: Horticulturae, 393: 170-173.

Joshi, I., Bisht, P., Sharma, V.K. and Uniyal, D., 2003. In vitro clonal propagation of mature Eucalyptus F1 hybrid (Eucalyptus tereticornisSM x E. grandis Hill ex Maiden. Silvae Genetica, 52: 110-113.

- Koriesh, E.M., Abd El-Fattah, Y.M., El-Dayem, M.A. and El-Etriby, M.A., 2002. Micropropagation of juvenile Eucalyptus citriodora. Acta Horticulture, 625: 283-288.

- Lakshmi-sita, G., 1993. Micropropagation of Eucalyptus. Kluwer Academic Publisher, Netherlands, 263-280.

- Le Roux, J.J. and Van Staden, J., 1991. Micropropagation and Tissue culture of Eucalyptus- a review. Tree physiology, Heron publishing- Victoria, Canada, 9: 435-477.

- Manders, G., Otoni, W.C., Dutra, W.C., Blackhall, F.B., Vaz, N.W., Power, J.B. and Davey, M.R., 1994. Transformation of Passionfruit (Passiflora edulis) using Agrobacterum tumefaciens. Plant Cell Reports, 13: 697-702.

- McComb, J.A., Bennet, I.J. and Tonkin, C., 1996. In vitro propagation of Eucalyptus species. In: Taji A.M. and Williams, R.P. (eds) Tissue culture of Australian plants. University of New England, Armidale: 112-156.

- McComb JA., Bennet I.J., 1986. Eucalyptus spp. In: Bajaj YPS, ed. Biotechnology in agriculture and forestry 1: Trees I. Berlin: Springer Verlag, 340-362.

- McLaughtin, J. and Karnoskey, D.F., 1989. Controlling vitrification in Larix deciduas via culture media manipulation. Canadian Journal of Forest Research, 19: 1334-1337.

- Nugent, G., Chandler, S.F., Whiteman, P. and Stevenson, T.W., 2001. Adventitious bud induction in Eucalyptus globulus Labill. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 37:388-391.

- Rahim, F., Jabeen, M. and Ilahi, I., 2003. Masspropagation in Eucalyptus camaldulensis Dehn. Asian Journal of Plant Science, 2(2):184-187.

- Turnbull, J.W. and Boland, D.J., 1984. Eucalyptus. Biologist, 31: 49-56.